De novo RNA-seq 서열 조립

소개

bioRxiv에 게재된 논문에서 새로운 코로나바이러스 아속이 확인되었습니다. 저는 해당 바이러스의 프로테아제에 변화가 있는지 알아보고 싶었습니다. 하지만 서열 데이터는 아직 공개되지 않았습니다.

다행히 NCBI에서는 유사한 서열을 구할 수 있었지만, 안타깝게도 RNA-seq 데이터만 이용할 수 있었습니다.

그래서 먼저 RNA-seq 리드를 조립한 다음, 필요한 서열을 조립 결과와 BLAST로 비교해야 했습니다.

요약

conda로 환경을 설정합니다:

BASH

conda create -n sra_env -y
conda activate sra_env
conda install -c bioconda -y sra-tools trinity transdecoder blast fastp fastqc

데이터를 내려받습니다:

BASH

prefetch SRR11301086
fasterq-dump SRR11301086
mkdir -p analysis_results/SRR11301086/{raw_fastqc,clean_fastqc,fastp,trinity,transdecoder,blast_results}

데이터 품질 확인

BASH

fastqc  SRR11301086_1.fastq SRR11301086_2.fastq \
        -o analysis_results/SRR11301086/raw_fastqc \
        -t 28 \
        2>&1 | tee analysis_results

fastp를 이용한 품질 관리

BASH

fastp -i SRR11301086_1.fastq \
      -I SRR11301086_2.fastq \
      -o analysis_results/SRR11301086/fastp/SRR11301086_1.clean.fastq \
      -O analysis_results/SRR11301086/fastp/SRR11301086_2.clean.fastq \
      --qualified_quality_phred 20 \
      --length_required 50 \
      --thread 28 \
      --html analysis_results/SRR11301086/fastp/SRR11301086_fastp.html \
      --json analysis_results/SRR11301086/fastp/SRR11301086_fastp.json \
      2>&1 | tee analysis_results/SRR11301086/logs/SRR11301086_fastp.log

데이터 품질 확인(정제 후 데이터)

BASH

fastqc analysis_results/SRR11301086/fastp/SRR11301086_1.clean.fastq \
       analysis_results/SRR11301086/fastp/SRR11301086_2.clean.fastq \
       -o analysis_results/SRR11301086/clean_fastqc \
       -t 28 \
       2>&1 | tee analysis_results/SRR11301086/logs/SRR11301086_fastqc_cleaned.log

Trinity로 조립

BASH

nohup Trinity --seqType fq \
        --left analysis_results/SRR11301086/fastp/SRR11301086_1.clean.fastq \
        --right analysis_results/SRR11301086/fastp/SRR11301086_2.clean.fastq \
        --CPU 28 --max_memory 48G \
        --output analysis_results/SRR11301086/trinity \
        2>&1 > analysis_results/SRR11301086/logs/SRR11301086_trinity.log &

mv analysis_results/SRR11301086/trinity.Trinity.fasta* analysis_results/SRR11301086/trinity/

Trinity 결과 확인

BASH

TrinityStats.pl analysis_results/SRR11301086/trinity/trinity.Trinity.fasta \
2>&1 | tee analysis_results/SRR11301086/logs/SRR11301086_trinity_stats.txt

관심 서열 BLAST

query.fasta에 서열을 넣습니다.
BASH
```
vi query.fasta
```

BLAST 데이터베이스를 만들고 실행합니다:

BASH

makeblastdb -in analysis_results/SRR11301086/trinity/trinity.Trinity.fasta -dbtype nucl -out analysis_results/SRR11301086/trinity/SRR11301086_nuc_db

tblastn -query query.fasta \
        -db analysis_results/SRR11301086/trinity/SRR11301086_nuc_db \
        -out analysis_results/SRR11301086/blast_results/SRR11301086_nuc_blast.txt \
        -evalue 1e-5 \
        -word_size 2 \
        -outfmt "6 qseqid sseqid pident length mismatch gapopen qstart qend sstart send evalue bitscore qseq sseq" \
        -num_threads 28

BLAST 결과 확인

BASH

cat analysis_results/SRR11301086/blast_results/SRR11301086_nuc_blast.txt

trinity.Trinity.fasta에서 서열 추출

BASH

# Build index
samtools faidx analysis_results/SRR11301086/trinity/trinity.Trinity.fasta
# Extract the sequence
samtools faidx analysis_results/SRR11301086/trinity/trinity.Trinity.fasta TRINITY_DN284_c0_g1_i7 > analysis_results/SRR11301086/blast_results/SRR11301086_TTRINITY_DN284_c0_g1_i7.fasta

마무리

예측된 서열로 BLAST를 수행할 수도 있습니다:

BASH

TransDecoder.LongOrfs -t analysis_results/SRR11301086/trinity/trinity.Trinity.fasta\
    2>&1 | tee analysis_results/SRR11301086/logs/SRR11301086_transdecoder_long.log

TransDecoder.Predict -t analysis_results/SRR11301086/trinity/trinity.Trinity.fasta \
    2>&1 | tee analysis_results/SRR11301086/logs/SRR11301086_transdecoder_predict.log

mv *.transdecoder* analysis_results/SRR11301086/transdecoder/

BLAST 데이터베이스를 만들고 실행합니다:

BASH

makeblastdb -in analysis_results/SRR11301086/transdecoder/trinity.Trinity.fasta.transdecoder.pep \
            -dbtype prot \
            -out analysis_results/SRR11301086/transdecoder/SRR11301086_db \
            2>&1 | tee analysis_results/SRR11301086/logs/SRR11301086_makeblastdb.log

blastp -query query.fasta \-db analysis_results/SRR11301086/transdecoder/SRR11301086_db \
       -out analysis_results/SRR11301086/blast_results/SRR11301086_prot_blast.txt \
       -evalue 1e-5 \
       -outfmt "6 qseqid sseqid pident length mismatch gapopen qstart qend sstart send evalue bitscore qseq sseq" \
       -num_threads 28 \
       2>&1 | tee analysis_results/SRR11301086/logs/SRR11301086_blast.log